YF021-50T RNASweAMI^TM原位杂交荧光信号检测试剂盒（无探针）^b组成及储存条件

^a通透剂有效成分为0.5% Triton X-100，针对不同的细胞可进行调整，如需更低浓度的Triton X-100通透处理细胞，可用无核酸酶的1×PBS对通透剂进行稀释后使用。

^b整套试剂可以用于检测50个面积约为20 mm×20 mm的组织点，当用于检测的样本面积较大时，每套试剂能完成的实验次数会相应减少。

RNASweAMI原位杂交简介

原位杂交（In situ hybridization），即YSH技术，基本原理是基于碱基互补配对原则，利用特定标记（如荧光素、地高辛等）的已知序列单链核酸作为探针，与待检测的细胞或组织切片中的靶基因（DNA或RNA）特异性结合，二者经碱基互补配对，形成靶基因与标记探针的杂交体。随后根据探针的标记物，利用不同的显色系统对杂交体进行显色及信号放大，从而对靶基因进行精确定量定位。根据探针的标记物不同，有荧光显色系统、DAB显色系统等。

RNASweAMI YSH原位杂交技术检测流程如图1所示，特异性的寡核苷酸探针通过碱基互补配对原则与组织样本中的靶标RNA杂交，然后通过两个“L”型结构（单链DNA）使得靶标处富集大量的信号探针，实现级联式信号放大，经明场或者荧光成像技术，可观察到靶标RNA处形成的明显点状或团簇状信号。相比于传统的原位杂交直标方法，该方法理论上可以将信号放大400-8000倍，实现单分子RNA的可视化，且具有很高信噪比。

本手册提供使用RNASweAMI原位杂交实验所需的特异性靶标探针（根据用户指定的基因提前设计及合成），荧光信号探针以及荧光信号检测试剂盒的指南和实验方案。

用户自备材料（见下表1所示）

表 1

*重要：所有用于原位杂交检测的试剂配制，需要用无酶耗材（各种规格的离心管，吸头等）以及经RNase灭活处理的器皿（例如玻璃烧杯，玻璃瓶等）。关于器皿的RNase灭活处理，可采用以下方法：

RNase灭活方法一：推荐使用专用的RNase灭活液（推荐Y3042，RNase灭活液(25×)），用无核酸酶稀释至1×，将玻璃烧杯、玻璃瓶以该溶液浸泡，然后置于60℃条件下孵育10 min进行RNase灭活。取出玻璃器皿，控干液体后即可用于本实验中各种试剂的配制。RNase灭活液可反复使用，具体使用方法可参见官网产品说明书。

RNase灭活方法二：使用DEPC灭活RNase。配制含0.1%DEPC的纯水，将需要处理的玻璃器皿以该溶液浸泡过夜后，取出玻璃容器，控干液体，然后将玻璃器皿进行121℃高温灭菌20 min。即可得到RNAse灭活的器皿，用于本实验中各种试剂的配制。

1 实验前准备

1.1 实验流程概览

1.2 试剂准备

(1) 配制1×修复液：将修复液（20×）(pH 6.0)用无核酸酶水稀释20倍，即1 mL修复液（20×）与19 mL无核酸酶水混匀。

(2) 配制Proteinase K工作液：将Proteinase K用1×PBS稀释10倍，即每100 μL Proteinase K与900 μL 1×PBS混匀，得到Proteinase K工作液。

(3) 配制靶标探针混合物1杂交液：靶标探针混合物1用杂交液稀释5倍。

(4) 配制靶标探针混合物2杂交液：靶标探针混合物2用杂交液稀释5倍。

(5) 配制2×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释10倍，即每1 mL 20×SSC与9 mL无酶水混匀。

(6) 配制1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释20倍，即每1 mL 20×SSC与19 mL无酶水混匀。

(7) 配制0.5×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释40倍，即每1 mL 20×SSC与39 mL无酶水混匀。

(8) 配制0.1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释200倍，即每1 mL 20×SSC与199 mL无酶水混匀。

(9) 配制信号探针杂交液：将探针试剂盒中相应的荧光信号探针（200×）用杂交液稀释200倍。

2 样本前处理

2.1 组织石蜡切片

(1) 脱蜡复水：制备好的组织石蜡切片（3-5 μm）依次进入二甲苯I 15 min-二甲苯II 15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-无核酸酶水。

(2) 热修复：1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒置于提前加温至100℃的水浴锅内，继续保温至1×修复液沸腾并维持15 min，然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5min。

(3) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化20-30 min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5 min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

2.2组织冰冻切片

(1) 固定：冰冻切片经室温静置5-10 min复温干燥后，滴加试剂盒内配套的固定液覆盖组织，室温固定10-15 min，晾干后以1×PBS清洗3次，每次5 min。

(2) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化5-15 min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5 min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果，必要时可用修复液高温修复）。

2.3 贴壁细胞样本

(1) 固定：去除细胞培养板中的培养基，用1×PBS缓冲液（无核酸酶）清洗1次，之后向孔板内加入固定液1-2 mL覆盖细胞，室温固定10-15 min后，以1×PBS清洗3次，每次5 min。

(2) 破膜：在细胞培养板中滴加300-500 μL通透剂覆盖细胞，室温孵育20 min后，1×PBS洗3次，每次5 min。

(3)