植物原位杂交试剂盒订购，请下载RNASweAMI植物原位杂交（BCIP NBT）检测试剂盒订购信息表

GF012-50T  RNASweAMI^TM植物原位杂交（BCIP/NBT）检测试剂盒(无探针)组成及储存条件

^b整套试剂可以用于检测50个面积约为20 mm×20 mm的组织点，当用于检测的样本面积较大时，每套试剂能完成的实验次数会相应减少。

^c所有试剂在存储条件下有效期12个月，整个试剂盒冰袋低温运输。

RNASweAMI原位杂交简介

原位杂交（In situ hybridization），即YSH技术，基本原理是基于碱基互补配对原则，利用特定标记（如荧光素、地高辛等）的已知序列单链核酸作为探针，与待检测的细胞或组织切片中的靶基因（DNA或RNA）特异性结合，二者经碱基互补配对，形成靶基因与标记探针的杂交体。随后根据探针的标记物，利用不同的显色系统对杂交体进行显色及信号放大，从而对靶基因进行精确定量定位。根据探针的标记物不同，有荧光、DAB、BCIP/NBT显色系统等。

RNASweAMI YSH原位杂交技术检测流程如图1所示，特异性的寡核苷酸探针通过碱基互补配对原则与组织样本中的靶标RNA杂交，然后通过两个“L”型结构（单链DNA）使得靶标处富集大量的信号探针，实现级联式信号放大，经明场或者荧光成像技术，可观察到靶标RNA处形成的明显点状或团簇状信号。相比于传统的原位杂交直标方法，该方法理论上可以将信号放大400-8000倍，实现单分子RNA的可视化，且具有很高信噪比。

本手册提供使用RNASweAMI原位杂交实验所需的特异性靶标探针（根据用户指定的基因提前设计及合成）、地高辛标记的信号探针以及BCIP/NBT信号检测试剂盒的指南和实验方案。

用户自备材料（见下表1所示）

表 1

*重要：所有用于原位杂交检测的试剂配制，需要用无酶耗材（各种规格的离心管，吸头等）以及经RNase灭活处理的器皿（例如玻璃烧杯，玻璃瓶等）。关于器皿的RNase灭活处理，可采用以下方法：

RNase灭活方法一：推荐使用专用的RNase灭活液（推荐Y3042，RNase灭活液(25×)），用无核酸酶稀释至1×，将玻璃烧杯、玻璃瓶以该溶液浸泡，然后置于60℃条件下孵育10 min进行RNase灭活。取出玻璃器皿，控干液体后即可用于本实验中各种试剂的配制。RNase灭活液可反复使用，具体使用方法可参见官网产品说明书。

RNase灭活方法二：使用DEPC灭活RNase。配制含0.1%DEPC的纯水，将需要处理的玻璃器皿以该溶液浸泡过夜后，取出玻璃容器，控干液体，然后将玻璃器皿进行121℃高温灭菌20 min。即可得到RNAse灭活的器皿，用于本实验中各种试剂的配制。

1 实验前准备

1.1 实验流程概览

1.2 试剂准备

(1) 配制1×修复液：将修复液（20×）用无核酸酶水稀释20倍，即1 mL修复液（20×）与19 mL无核酸酶水混匀。

(2) 配制Proteinase K工作液：将Proteinase K用1×PBS稀释10倍，即每100 μL Proteinase K与900 μL 1×PBS混匀，得到Proteinase K工作液。

(3) 配制靶标探针混合物1杂交液：靶标探针混合物1用杂交液稀释5倍。

(4) 配制靶标探针混合物2杂交液：靶标探针混合物2用杂交液稀释5倍。

(5) 配制DIG信号探针杂交液：将DIG probe（300×）用杂交液稀释300倍，即每1 μL DIG probe（300×）与299 μL杂交液混匀。

(6) 配制anti-DIG（AP）工作液：将anti-DIG (AP)用1×PBS稀释400倍，即每1 μL anti-DIG (AP)与399 μL 1×PBS混匀。

(7) 配制封闭工作液：将试剂盒提供的封闭液（浓缩型）用1×PBS稀释10-20倍即可。

(8) 配制BCIP/NBT显色液：按1 mL无核酸酶水加50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，混匀。注意，此溶液需现配现用。

(9) 配制2×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释10倍，即每1 mL 20×SSC与9 mL无酶水混匀。

(10) 配制1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释20倍，即每1 mL 20×SSC与19 mL无酶水混匀。

(11) 配制0.5×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释40倍，即每1 mL 20×SSC与39 mL无酶水混匀。

(12) 配制0.1×SSC：将20×SSC用无核酸酶水稀释200倍，即每1 mL 20×SSC与199 mL无酶水混匀。

2样本前处理

2.1 植物组织石蜡切片

(1) 组织固定：组织PBS漂洗后立即放入原位杂交固定液中4℃固定12 h以上，真空泵抽气，可4℃保存运输。

(2) 脱水浸蜡包埋：组织固定完成后在通风橱内切取目的区域组织块约3 mm厚，经由低到高梯度酒精脱水后二甲苯透明，浸蜡包埋。

(3) 石蜡切片：组织石蜡块经切片机切片6 μm厚，摊片机捞片，62°烤箱烤片2 h。

(4) 脱蜡复水：制备好的组织石蜡切片依次进入二甲苯I 15 min-二甲苯II 15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-无核酸酶水。

(5) 微波修复：取适量1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒放于微波炉，中火7 min，停火7 min，低火10 min（微波炉温度控制在85°左右），然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5 min。

(6) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化20-30 min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5 min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果）

2.2植物组织冰冻切片

(1) 固定：冰冻切片经室温静置5-10 min复温干燥后，滴加试剂盒内配套的固定液覆盖组织，室温固定10-15 min，晾干后以1×PBS清洗3次，每次5 min。

(2) 微波修复：1×修复液置于抗原修复盒内，将组织切片浸没于1×修复液中，将抗原修复盒放于微波炉，中火7 min，停火7 min，低火10 min（微波炉温度控制在85°左右），然后取出抗原修复盒，自然冷却至室温，1×PBS清洗3次，每次5 min。

(3) 消化：用免疫组化笔画圈圈住组织，向圈内滴加Proteinase K工作液覆盖组织，置于37℃消化5-15 min，之后切片经1×PBS洗3次，每次5 min。（最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整，以获得最佳实验效果，必要时可用修复液高温修复）。

3 原位杂交检测

(1) 预杂交：轻轻甩干切片后，将切片水平置于湿盒内，滴加杂交液（恢复室温）覆盖样本，盖上湿盒盖子，将湿盒（事先预热）整体置于预热的杂交仪内65℃孵育25 min，此过程需注意防止干片。

(2) 靶标探针1杂交：探针孵育：倾去杂交液，滴加靶标探针混合物1杂交液（恢复室温）约60 μL覆盖样本，水平置于湿盒内，然后将湿盒置于杂交仪内37°C孵育过夜，此过程需注意密封湿盒防止干片。

(3) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物1杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于室温漂洗，各10 min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(4) 靶标探针2杂交：轻轻甩干切片，滴加靶标探针混合物2杂交液（恢复室温）约60 μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内37℃孵育25 min。注意：湿盒底部加入50 mL 2×SSC，防止干片。

(5) 杂交后洗涤：倾去靶标探针混合物2杂交液，切片依次经37°C预热的2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC于室温漂洗各5 min。注意：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。

(6) 地高辛信号探针杂交：轻轻甩干切片，滴加DIG信号探针杂交液（恢复室温）约60 μL覆盖样本，水平置于湿盒内，将湿盒置于杂交仪内37℃孵育3 h。注意：湿盒底部加入50 mL 2×SSC，防止干片。

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