天然蛋白的免疫沉淀方法

天然蛋白的免疫沉淀方法

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印迹或是激酶活性分析

A. 所需溶液和试剂

注意：所有溶液用反渗透去离子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相当纯度的水配制。

1.   20 X 磷酸盐缓冲生理盐水 （PBS）: (#9808) 配制1L 1 X PBS时，取50 ml 20 X PBS用950 ml RODI水稀释到1L，混匀。

2.   10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X细胞裂解液时，取100 ml 细胞裂解液加950 ml RODI水稀释到1L，混匀。注意：使用前添加1 mM PMSF。

3.   蓝色上样缓冲液（SDS上样缓冲液）：（#7722）。 配制新鲜的3 X还原性SDS上样缓冲液，在3X SDS上样缓冲液中加入十分之一的30X的还原剂（1.25M）。

4.   蛋白A或G琼脂糖微球（用于未标记的一抗）：（处理后可以在4°C保存2星期）。按照产品说明处理。蛋白A用于兔IgG抗体的沉淀，蛋白G用于小鼠IgG抗体的沉淀。

5.   固定有抗生物素蛋白Streptavidin的微球（用于生物素标记的抗体）: (#3419) 用前稍加震荡，每个免疫下拉反应用10 μl。

6.   10X 激酶缓冲液:（#9802） 配制1 ml 1X激酶缓冲液时，取100 μl 10 X激酶缓冲液用900 μl RODI水稀释到1ml，混匀。

7.   ATP (10 mM): （#9804） 配制0.5 ml 200 μM ATP时，取10 μl ATP（10 mM）加入到490 μl 1X 激酶缓冲液中。

B. Preparing Cell Lysates细胞裂解物制备

1.   吸去培养基。加入含调节因子的新鲜培养基，处理所需的时间。

2.   在非变性条件下收集细胞，去掉培养基，用冰PBS清洗一次。

3.   去掉PBS，每个板（10cm）中加0.5 ml冰预冷的1 X细胞裂解液，在冰上孵育5分钟。

4.   将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。置于冰上。

5.   冰浴中对样品用超声处理3次，每次5秒钟。

6.   4°C，14000 X g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。如有需要，样品可以保存在-80°C。

C. 免疫沉淀

细胞裂解物预处理（对于未标记或生物素标记抗体而言是可选步骤）

1.   取200 μl 1 mg/ml的细胞裂解物，在其中加入10–30 μl 50%的蛋白A或G琼脂糖微球浆（用于未标记的一抗）或10 μl抗生物素链菌素微球（用于生物素标记的抗体）

2.   4°C孵育30-60分钟。

3.   4°C离心10分钟。将上清转移到新的管中。

4.   根据所用一抗选择下面合适的操作步骤进行实验。

使用未标记一抗

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入一抗。在4°C转子上孵育过夜。

2.   加入蛋白A或G琼脂糖微球（10-30 μl 50% 微球浆）。4°C转子上孵育1-3个小时。

3.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。

使用生物素标记的一抗

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入生物素标记的一抗。在4°C转子上孵育过夜。

2.   稍加震荡。加入固定化抗生物素链菌素（与微球偶联）（#3419）（10μl）。在4°C转子上孵育2小时。

3.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。

使用固定化抗体（与微球偶联）

1.   14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入固定化抗体10 μl。在4°C转子上孵育过夜。

2.   4°C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

3.   取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析（见下文）。

D. 样品分析

继续下述任一种操作：

Western免疫印迹分析

1.   将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬。震荡后离心30秒。

2.   把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。

3.   取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶（4–20%）上。

4.   Western 免疫印迹分析检测（参考 Western Immunoblotting方法）。

注意：对于分子量约为50 kDa的蛋白，我们推荐使用小鼠抗兔IgG（轻链特异）（L57A3）mAb #3677或小鼠抗兔 IgG（构象特异）（L27A9）mAb #3678作为二抗，以减少变性重链产生的遮蔽作用。对于分子量接近25 kDa的蛋白，推荐使用小鼠抗兔IgG（构象特异） （L27A9）mAb #3678。

激酶活性分析

1.   沉淀用500 μl 1X激酶缓冲液清洗2次。置于冰上。

2.   将沉淀用添加有200 μM ATP和底物的40 μl 1X激酶缓冲液重悬沉淀。

3.   30°C孵育30分钟。

4.   加入20 μl 3X SDS上样缓冲液终止反应。震荡后离心30秒。

5.   将含有磷酸化底物的上清转移到新的管中。

6.   把样品放在95–100°C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。

7.   取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶（4–20%）上。