DCF法测定ROS

（1）原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测 DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
（2）材料与仪器
DCFH-DA购自Sigma公司，分子量487，用DMSO溶解，4.87 mg/ml 配成10 Mm，终浓度稀释成25µM; FLUOstarOPTIMA 酶标仪。
 
（3）步骤
① 接种细胞：96孔板，接种细胞数为每孔1.5万个细胞。
② DCFH-DA孵育：接种24小时后用有糖earle’s 液洗两遍，并换上终浓度为25µM DCFH-DA培养箱孵育30 min.
③ 处理：DCFH-DA孵育结束后，用有糖earle’s 液洗两遍给予处理（氧化应激或药物）。
④ 检测：FLUOstarOPTIMA 酶标仪检测荧光， 488nm 激发波长，525nm发射波长。
 
（4）注意点
① 要有无DCFH-DA孵育的对照；
② 多次清洗，注意操作规范，不要将细胞洗掉。
③ 如果处理4小时以内，可以先孵育荧光染料，再处理后检测；如果处理超过4小时，建议先处理，再孵育染料检测。